Reequilibrada a situação, novos abalos surgiriam em 1864, dessa vez com relação ao Paraguai , governado por Francisco Solano López. Em disputa estava a hegemonia da região, sobretudo porque os paraguaios necessitavam da bacia Platina para ter acesso ao oceano Atlântico e ameaçavam os interesses argentinos e brasileiros. Para o Brasil , tratava-se de manter as províncias de Mato Grosso e do Rio Grande do Sul integradas ao império monárquico e garantir a navegação pelos rios Paraguai e Uruguai. A Guerra do Paraguai iniciou-se em novembro de 1864, quando os paraguaios aprisionaram um navio de guerra brasileiro. Mais do que uma agressão fruto de uma política expansionista de um ditador , como em geral a historiografia costuma apontar , a guerra era uma resposta à ofensiva também expansionista do Império Brasileiro na região. Dois meses antes, o Brasil havia interferido , mais uma vez, na política interna do Uruguai, para levar seus aliados colorados ao poder. Como na maior parte das guerras, apesar de todos os apelos nacionalistas, não se tratava da luta do bem contra o mal. Uma intrincada rede de alianças acabou por isolar o Estado paraguaio. As rivalidades com a Argentina falaram mais alto e, em 1865, os governos argentino , uruguaio e brasileiro formaram a Tríplice Aliança contra Solano López. O presidente argentino , Bartolomé Mitre, tornou-se o comandante das forças aliadas. A superioridade demográfica e econômica dos aliados contrabalançava com a melhor preparação do Exército paraguaio que, no início do conflito , contava com cerca de 60 mil combatentes , contra 17 mil do Brasil, 8 mil da Argentina e apenas mil do Uruguai . As forças aliadas tinham , no entanto, ampla vantagem naval, sobretudo por causa da Marinha brasileira. E contavam com financiamento e apoio da poderosa Inglaterra. Se nos primeiros combates as forças equilibravam-se e até mesmo os paraguaios puderam contar com alguns expressivos sucessos, logo o poder dos aliados se fez sentir. O Brasil chegou a mobiliar cerca de 150 mil homens, distribuídos entre o Exército , a Guarda Nacional e o corpo de voluntários da Pátria. Em lugar de se apresentarem ao serviço militar , muitos proprietários cederam seus escravos , que , a partir de 1866, passaram a receber alforria pela sua participação na guerra. Após uma matança sem precedentes na América do Sul, os paraguaios foram derrotados em março de 1870. Destruída , a República do Paraguai jamais se recuperou do desastre militar. Sua população masculina foi praticamente dizimada e metade de seus habitantes foi morta durante os combates. Nunca mais ameaçaria a hegemonia brasileira na região do Prata , sendo , até hoje , uma parceiro menor dos países do Cone Sul (Brasil, Argentina, Chile e Uruguai).
